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聚丙烯酰胺凝胶电泳原理和需要注意的地方

时间:2021-06-21 03:54:12来源:本站 作者:admin 点击:

  聚丙烯酰胺凝胶电泳简称PAGE(聚丙烯酰胺?凝胶?聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的以聚丙烯酰胺凝胶为支撑介质的电泳技术。以单体丙烯酰胺和亚甲基二丙烯酰胺为原料,通过聚合反应合成了聚丙烯酰胺凝胶。聚合过程是由自由基催化的。

聚丙烯酰胺凝胶电泳原理和需要注意的地方

  聚丙烯酰胺凝胶电泳:

  用于分离蛋白质和寡核苷酸。

  聚丙烯酰胺凝胶电泳原理:

  催化聚合有两种常用方法:化学聚合和光聚合。化学聚合通常是在催化剂过硫酸铵(AP)和促进剂四亚甲基二胺(TEMED)的作用下,四亚甲基二胺催化过硫酸铵产生自由基。溶液的pH值对聚合反应很重要,因为过低的pH值将没有足够的碱来加速催化反应,过多的氧分子将很快停止聚合反应。因此,要制成凝胶,必须在加入过硫酸铵之前排出混合物中的空气。核黄素催化聚合通常用于生产浓缩凝胶,因为得到的凝胶具有较大的孔隙率。核黄素在光照和微量氧存在下产生自由基使ACR聚合。

  聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和亚甲基二丙烯酰胺的浓度来控制,其浓度可以在3%到30%之间。低浓度凝胶具有较大的孔径,如3%聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻断作用,可用于平板等电聚焦或SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中的浓缩凝胶,也可用于DNA分离;高浓度凝胶具有较小的孔径,可作为蛋白质的分子筛。它们可以在电泳中根据分子量分离蛋白质。例如,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳常用10%-20%的凝胶作为分离凝胶。选择T和C的经验公式为:C=6.5-0.3T。该公式可用于计算T为5%~20%时的凝胶组成。C值不是很严格,在大多数情况下,可以改变1%左右的范围,当C不变时,凝胶的有效孔径随着T的增大而减小,T保持不变,当C为4%时,有效孔径小,C大于或小于4%,有效孔径较大,C大于5%时凝胶易碎,不利于使用。实验中常用的C值分别为2.6%和3%。

  聚丙烯酰胺凝胶的优点:

  1.可随意控制凝胶浓度“T”和交联度“C”,从而获得不同分子量的生物大分子分离所需的不同有效孔径x%的

  2、可以将分子筛作用和电荷效应结合在一起,在同一方法中,达到更高的灵敏度:10-9~10-12mol/L。

  3.由于聚丙烯酰胺凝胶是由a-C-C-键结合的酰胺聚合物,侧链只有一个不活泼的酰胺基-Co-NH2,没有带电荷的其他离子基。它在化学上是惰性的,当电泳发生时不会产生“电渗”。

  4.电泳分离可生产高纯度单体原料,重复性好。

  5、透明度好,便于拍照和复印。机械强度好,弹性好,不易破碎,操作和存放方便。

  无紫外吸收,无染色,可用紫外波长凝胶扫描进行定量分析。

  7.也可用作固定酶的惰性载体。

  聚丙烯酰胺凝胶电泳体系有连续体系和间断体系两种。前者意味着整个电泳系统所用的缓冲液组成、pH值和凝胶筛孔都是相同的。后者是指在电泳系统中使用两种或两种以上的缓冲液、pH值和孔径。根据电泳设备的不同,可分为垂直管(盘)电泳和垂直板电泳。两种电泳方法基本相同,只是用于凝胶的支架不是玻璃管就是玻璃板。以不连续体系中的管盘电泳为例,阐述了凝胶分离蛋白质的机理。